Prosjektnummer
901955
The Parvicapsula pseudobranchicola life cycle: How can we avoid or live with parvicapsulosis? (ParviLIFE)
Parvicapsulose er en sykdom forårsaket av parasitten Parvicapsula pseudobranchicola (Pp); et betydelig problem i oppdrett av laks i Nord-Norge og nå også på Island. Laksen smittes av vannbårne sporer (actinosporer) frigjort fra en børstemakk, som er sluttverten til parasitten. Denne verten har hittil vært ukjent, men ble nylig ble påvist i prøver tatt ved oppdrettsanlegg på Island.
Parasittens smittedynamikk er tidligere kartlagt, laksen smittes fra sent i juli og utover høsten. Smitten antas frigjort fra børstemakk-verten i denne perioden, og makk må derfor undersøkes for smittefrigjøring nettopp på høsten. Sykdommen opptrer 4–6 måneder senere. Skjerming mot overflatevann synes ikke å beskytte mot smitte (tidligere prosjekt). Infeksjoner er nå påvist i makk som lever på 40–60 m dyp, så det kan nå vise seg at smitten frigjøres under sprangsjiktet.
Parasittens smittedynamikk er tidligere kartlagt, laksen smittes fra sent i juli og utover høsten. Smitten antas frigjort fra børstemakk-verten i denne perioden, og makk må derfor undersøkes for smittefrigjøring nettopp på høsten. Sykdommen opptrer 4–6 måneder senere. Skjerming mot overflatevann synes ikke å beskytte mot smitte (tidligere prosjekt). Infeksjoner er nå påvist i makk som lever på 40–60 m dyp, så det kan nå vise seg at smitten frigjøres under sprangsjiktet.
Børstemakkverten er det naturlige reservoaret som frigjør smitte. For å forebygge smitte eller sykdom er det viktig å kartlegge makkens forekomst (habitat), parasittens prevalens, om nærbeslektetede arter også smittes/bidrar til smittepress, og makkenes tilknytning til lakseoppdrettsanlegg og tilhørende organisk belastning. Dernest må makken kunne tas inn i laboratoriet, holdes i akvarier og en må få dem til å frigjøre smitte. Når en kan samle actinosporer og disse beviselig smitter laksen har man en grov smittemodell, som så kan utvikles videre.
Eksperimenter med smitten (actinosporene) og smittet fisk gir mange muligheter for studier på mottakelighet og infeksjonen når det gjelder robust fisk, fôr, betydningen av koinfeksjoner, smittepress og miljøfaktorer for sykdomsutvikling.
En kan påvise parasitten i vannprøver (eDNA), men en vet da ikke om en har påvist sporer som kan smitte fisk (actinosporer) eller sporer frigjort fra fisken (myxosporer). De siste er kun infektive for makkverten.
Skal en kunne måle smittepress direkte i sjøvann, må en kunne skille mellom nukleinsyrer fra sporetypene. Siden parasitten forekommer i hele Norge, men forårsaker sykdom mest i nord, er det også mulig der er flere varianter av parasitten med forskjellig virulens. Dette kan nå undersøkes ved å sammenligne genomer fra parasitten i børstemakk samlet i både sør og nord. Slik kunnskap er viktig for vår evne til å predikere risiko for parvicapsulose.
Strategier for forebygging og bekjempelse av sykdommen må følgelig baseres på detaljert informasjon om de biologiske egenskapene og livssyklusen til Pp, fremskaffet i prosjektet.
En kan påvise parasitten i vannprøver (eDNA), men en vet da ikke om en har påvist sporer som kan smitte fisk (actinosporer) eller sporer frigjort fra fisken (myxosporer). De siste er kun infektive for makkverten.
Skal en kunne måle smittepress direkte i sjøvann, må en kunne skille mellom nukleinsyrer fra sporetypene. Siden parasitten forekommer i hele Norge, men forårsaker sykdom mest i nord, er det også mulig der er flere varianter av parasitten med forskjellig virulens. Dette kan nå undersøkes ved å sammenligne genomer fra parasitten i børstemakk samlet i både sør og nord. Slik kunnskap er viktig for vår evne til å predikere risiko for parvicapsulose.
Strategier for forebygging og bekjempelse av sykdommen må følgelig baseres på detaljert informasjon om de biologiske egenskapene og livssyklusen til Pp, fremskaffet i prosjektet.
Hovedmål
Å skape et kunnskapsgrunnlag for parasitten P. pseudobranchicola (Pp) som kan støtte opp under strategier for forebygging av parvicapsulose i lakseoppdrett.
Å skape et kunnskapsgrunnlag for parasitten P. pseudobranchicola (Pp) som kan støtte opp under strategier for forebygging av parvicapsulose i lakseoppdrett.
Delmål
• Å beskrive detaljert livssyklusen til Pp, både i laks (mellomvert) og børstemark (sluttvert).
• Å kartlegge utbredelsen og populasjonstettheten til sluttverten i forskjellige habitater i Norge og på Island.
• Å klarlegge parasittens prevalens i sluttverten i forhold til oppdrett.
• Å etablere en smittemodell for Pp.
• Å påvise faktorer avgjørende for infeksjonsintensitet og dermed sykdom i smitteforsøk.
• Avklare levetiden til smitten (actinosporer) i sjø.
• Å etablere miljø-DNA-metodikk for å kvantifisere smitte i sjøvann.
• Å sekvensere og annotere genomet til Pp.
• Å beskrive den genetiske variasjonen til parasitten relatert til geografi, vert og forekomst av sykdom.
Følgende nytteverdi er forventet:
• Prosjektet er basert på at kunnskap om parasittens livssyklus nå er oppnåelig. Tidligere studier har vært hemmet av dette, og har måttet indirekte observere smitte ved overvåking av laks, og har hatt hovedvekt på infeksjoner i mellomverter (laksefisk).
• Prosjektet er basert på at kunnskap om parasittens livssyklus nå er oppnåelig. Tidligere studier har vært hemmet av dette, og har måttet indirekte observere smitte ved overvåking av laks, og har hatt hovedvekt på infeksjoner i mellomverter (laksefisk).
• Ved måloppnåelser vil dette prosjektet tillate både modellering av og direkte kvantifisering av smitte i vann. Habitater (bunntyper) egnet for sluttverten vil trolig representere en betydelig risiko når det gjelder parvicapsulose i laksemerder, og med forståelsen av lokal hydrodynamikk kan en forutse og redusere eksponering av merdsatt fisk.
• En smittemodell vil tillate videre (og kontrollerte) studier på den lite kjente sykdommen, og dermed effekter av genetikk, fôr, velferd og andre infeksjoner på Pp-infeksjoner. Det vil også kunne testes kjemoterapeutika og vaksinekandidater.
• Gi råd om beste praksis for å forebygge parvicapsulose basert på ny kunnskap om parasitten og hovedverten og risikofaktorer for sykdommen.
Prosjektet er organisert i 5 arbeidspakker (AP-er), hvorav den ene (AP1) er en ren administrativ arbeidspakke som ikke omtales her:
Beskrivelse: Denne arbeidspakken vil gjennomføres som feltarbeid både i Norge og på Island på utvalgte oppdrettslokaliteter hvor det er problemer med parvicapsulose. Sedimentprøver vil bli samlet inn med en Van Veen-grabber, sedimentet vil bli beskrevet (sandholdig, gjørmete etc.) og deretter filtrert, temperatur og saltholdighet registrert. Etter filtrering vil alle sluttverter (børstemark) og andre arter i samme slekt sorteres ut, og et utvalg prøver vil bli screenet for tilstedeværelse av P. pseudobranchicola ved bruk av qPCR (deteksjonsverktøy), både i felt ved hjelp av en håndholdt qPCR-maskin og/eller senere i laboratoriet. Artsidentiteten til børstemark som blir funnet positive for P. pseudobranchicola vil bli bekreftet ved DNA-sekvensering/-strekkoding. For å vurdere artsmangfoldet innen den aktuelle slekten børstemark vil også et utvalg av disse identifiseres til art ved DNA-strekkoding. Antallet sluttverter i hver prøve vil bli talt opp og populasjonstettheten (individer/m2) vil bli estimert. Prøver med høye infeksjoner med P. pseudobranchicola funnet i AP2 vil bli brukt til genom- og transkriptomsekvensering (AP5) og til smitteforsøk i AP4.
AP2: Sluttverten- utbredelse, populasjonstetthet og habitatpreferanser
Deltakere: Institute for Experimental Pathology at Keldur (Keldur), Universitetet i Bergen (UiB) og Veterinærinstituttet
Deltakere: Institute for Experimental Pathology at Keldur (Keldur), Universitetet i Bergen (UiB) og Veterinærinstituttet
I AP2 vil man gjennomføre en detaljert kartlegging av biologien til sluttverten til P. pseudobranchicola noe som inkluderer:
a. geografisk utbredelse og populasjonstetthet
b. habitatpreferanser
c. prevalensen til P. pseudobranchicola i sluttverten i forhold til geografi.
a. geografisk utbredelse og populasjonstetthet
b. habitatpreferanser
c. prevalensen til P. pseudobranchicola i sluttverten i forhold til geografi.
Beskrivelse: Denne arbeidspakken vil gjennomføres som feltarbeid både i Norge og på Island på utvalgte oppdrettslokaliteter hvor det er problemer med parvicapsulose. Sedimentprøver vil bli samlet inn med en Van Veen-grabber, sedimentet vil bli beskrevet (sandholdig, gjørmete etc.) og deretter filtrert, temperatur og saltholdighet registrert. Etter filtrering vil alle sluttverter (børstemark) og andre arter i samme slekt sorteres ut, og et utvalg prøver vil bli screenet for tilstedeværelse av P. pseudobranchicola ved bruk av qPCR (deteksjonsverktøy), både i felt ved hjelp av en håndholdt qPCR-maskin og/eller senere i laboratoriet. Artsidentiteten til børstemark som blir funnet positive for P. pseudobranchicola vil bli bekreftet ved DNA-sekvensering/-strekkoding. For å vurdere artsmangfoldet innen den aktuelle slekten børstemark vil også et utvalg av disse identifiseres til art ved DNA-strekkoding. Antallet sluttverter i hver prøve vil bli talt opp og populasjonstettheten (individer/m2) vil bli estimert. Prøver med høye infeksjoner med P. pseudobranchicola funnet i AP2 vil bli brukt til genom- og transkriptomsekvensering (AP5) og til smitteforsøk i AP4.
AP3: Livvsyklusen til P. pseudobranchicola in vivo
Deltakere: Keldur, UiB og Veterinærinstituttet
Beskrivelse: Basert på resultater fra AP2 vil man velge ut et mindre antall lokaliteter som vil overvåkes regelmessig med hensyn på smittebelastning og utviklingsstadiet til P. pseudobranchicola både i sluttvert, fisk og i miljøet på samme tid.
Det vil bli tatt månedlige prøver bestående av børstemark og sediment ved bruk av samme metodikk som i AP2, pseudobrankier fra døende/død laks, sjøvann–miljø-DNA (3 x 5 L fra hvert prøvetakingssted/dybde). Alle sluttverter vil bli sortert ut fra prøvene og 20–30 av individene vil bli undersøkt i mikroskop for å se etter aktinosporer og/eller pre-sporogoniske stadier av P. pseudobranchicola. Deretter testes de for tilstedeværelse av P. pseudobranchicola med qPCR. Et utvalg individer vil også bli fiksert for histologi og in situ hybridisering, for å kunne studere utviklingsstadier så vel som målorganet til P. pseudobranchicola i sluttverten og den antatte patologien den kan forårsake også i denne verten. Prøver fra pseudobrankiene fra laks, ca. 20 fisk per prøvepunkt vil undersøkes for tilstedeværelse av P. pseudobranchicola med qPCR. Alle prøver undersøkes histologisk og et utvalg med in situ-hybridisering. Man vil optimalisere filtrerings- og DNA-ekstraksjonsprotokollene for å øke sensitiviteten til metoden.
Deltakere: Keldur, UiB og Veterinærinstituttet
I AP3 vil en beskrive livssyklusen til P .pseudobranchicola i detalj ved å overvåke infeksjonsstatus hos sluttvert, laks og sjøvann gjennom året. Man søker å identifisere på hvilke tidspunkter modne actinosporer (i sluttverten) og myxosporer (i laksen) er tilstede.
Beskrivelse: Basert på resultater fra AP2 vil man velge ut et mindre antall lokaliteter som vil overvåkes regelmessig med hensyn på smittebelastning og utviklingsstadiet til P. pseudobranchicola både i sluttvert, fisk og i miljøet på samme tid.
Det vil bli tatt månedlige prøver bestående av børstemark og sediment ved bruk av samme metodikk som i AP2, pseudobrankier fra døende/død laks, sjøvann–miljø-DNA (3 x 5 L fra hvert prøvetakingssted/dybde). Alle sluttverter vil bli sortert ut fra prøvene og 20–30 av individene vil bli undersøkt i mikroskop for å se etter aktinosporer og/eller pre-sporogoniske stadier av P. pseudobranchicola. Deretter testes de for tilstedeværelse av P. pseudobranchicola med qPCR. Et utvalg individer vil også bli fiksert for histologi og in situ hybridisering, for å kunne studere utviklingsstadier så vel som målorganet til P. pseudobranchicola i sluttverten og den antatte patologien den kan forårsake også i denne verten. Prøver fra pseudobrankiene fra laks, ca. 20 fisk per prøvepunkt vil undersøkes for tilstedeværelse av P. pseudobranchicola med qPCR. Alle prøver undersøkes histologisk og et utvalg med in situ-hybridisering. Man vil optimalisere filtrerings- og DNA-ekstraksjonsprotokollene for å øke sensitiviteten til metoden.
AP4: Smittemodell og parasittens smittemekanismer
Deltakere: UiB og Keldur
Deltakere: UiB og Keldur
Beskrivelse: I AP4 vil en utvikle en smittemodell for P. pseudobranchicola i atlantisk laks og studere smittemekanismene til parasitten. I tillegg vil man identifisere faktorer som som påvirker parasittbelastningen (intensiteten) i fisken og dermed utviklingen av parvicapsulose. Levetiden til actinosporene i sjøvann vil også undersøkes, slik at det senere kan bli mulig å modellere sporespredning.
Laks eksponeres for actinosporer frigjort fra smittede hovedverter samlet i felt og holdt i akvarier i laboratoriet. Smitte avsløres ved qPCR-analyser på laksens blod. Etter et bekreftende pilotsmitteforsøk (Keldur) gjøres et hovedsmitteforsøk (UiB), der smittedose varieres (lav og høy), samt laksens immunstatus (normal og immunsvekket). Svekkelsen oppnås ved ip-injeksjon av prednisolon i vegetabilsk olje. I alle disse gruppene tilsettes det ueksponerte kohabitanter etter smitte.
Forsøket varer 4 måneder, som skal være tilstrekkelig tid for utvikling av parvicapsulose. Ved sluttuttaket tas hele pseudobrankier ut, den ene til histologi, og den andre til homogenisering og qPCR-kvantifisering av parasitten.
Forsøket varer 4 måneder, som skal være tilstrekkelig tid for utvikling av parvicapsulose. Ved sluttuttaket tas hele pseudobrankier ut, den ene til histologi, og den andre til homogenisering og qPCR-kvantifisering av parasitten.
Hvis smittedose har betydning forventes det at pseudobrankier fra høydosegruppen vil oppnå en høyere infeksjonsintensitet enn lavdosegruppens. Hvis kortisonindusert immunsvekkelse har betydning forventer man at prednisolon-gruppens pseudobrankier vil oppnå en høyere infeksjonsintensitet.
Hvis kohabitantfiskene er blitt smittet (qPCR positive), kan det bety at parasitten har evne til å smitte fra fisk til fisk som tidlige stadier (presporogone stadier). Dette er vist for noen få andre myxosporea under oppdrettsituasjoner med høye vertstettheter, men dette er neppe viktig i naturen. I smitteforsøkene inngår det kontrollgrupper, som prøvetas på tilsvarende måte. Komparativ histologi fra forsøksgruppene vil inngå i en planlagt MSc-studie i fiskehelse, ved BIO, UiB.
Beskrivelse: I AP5 vil man studere genetikken til P. pseudobranchicola for å kunne utvikle genetiske markører egnet til å skille stammer/varianter av parasitten og etablere qPCR-analyser som kan oppdage relevante varianter.
Hvis kohabitantfiskene er blitt smittet (qPCR positive), kan det bety at parasitten har evne til å smitte fra fisk til fisk som tidlige stadier (presporogone stadier). Dette er vist for noen få andre myxosporea under oppdrettsituasjoner med høye vertstettheter, men dette er neppe viktig i naturen. I smitteforsøkene inngår det kontrollgrupper, som prøvetas på tilsvarende måte. Komparativ histologi fra forsøksgruppene vil inngå i en planlagt MSc-studie i fiskehelse, ved BIO, UiB.
Aktinosporer samlet fra polychaetene vil også bli holdt i friskt rennende vann i laboratoriet, og tatt ut regelmessig for vitalitetstesting. Flere publiserte metoder vil bli brukt, blant annet eksponering for lakseslim (fører til skyting av sporenes neslekapsler), mikroskopi (sporoplasma-struktur) og vital-farging. Levetiden forventes å være et par uker (andre sammenlignbare myxosporea), men vil avhenge av temperatur og annet. Når en kjenner sporenes levetid og vertikalfordeling, og hovedvertenes habitater, kan det bli mulig å modellere spredning.
AP5: Genetikken til P. pseudobranchicola
Deltakere: Veterinærinstituttet, UiB og Keldur
Deltakere: Veterinærinstituttet, UiB og Keldur
Beskrivelse: I AP5 vil man studere genetikken til P. pseudobranchicola for å kunne utvikle genetiske markører egnet til å skille stammer/varianter av parasitten og etablere qPCR-analyser som kan oppdage relevante varianter.
Kunnskap om genetikken (genomet) til P. pseudobranchicola er viktig av mange grunner. For dette prosjektet er det av særlig betydning å vurdere om isolater fra ulike verter og lokaliteter er genetisk forskjellige (“genotyper”) og om disse har forskjellig evne til å forårsake sykdom. Tilstedeværelse av geografiske varianter eller varianter assosiert med spesifikke verter kan forklare hvorfor sykdommen parvicapsulose bare sees i noen områder innenfor parasittens totale utbredelsesområde.
Genetiske markører for ulike varianter kan benyttes til å forbedre diagnostikken, men også for påvisning av disse varianter i vannprøver, såkalt miljø-DNA-overvåking. Man vil sekvensere både genomet og transkriptomet til parasitten basert på prøver både fra laks (pseudobrankier) og sluttvert. Det vil legges særlig vekt på å optimalisere gode metoder for oppkonsentrering og rensing av myxosporer (f.eks. Percoll-sentrifugering) for å oppnå DNA fra P. pseudobranchicola av høy konsentrasjon. Prøvene vil sekvenseres både med Illumina og PacBio-sekvensering og deretter vil de analyseres med bioinformatiske verktøy.
Markører for å studere forskjellige genetiske varianter vil deretter blir utviklet og brukt på vevsprøver innhentet gjennom prosjektet og prøver som allerede finnes i samlingene til prosjektdeltakerne. qPCR-analyser for påvisning av de forskjellige variantene kan bli utviklet og optimalisert for bruk i andre arbeidspakker og for diagnostikk og miljø-DNA-analyser.
Genetiske markører for ulike varianter kan benyttes til å forbedre diagnostikken, men også for påvisning av disse varianter i vannprøver, såkalt miljø-DNA-overvåking. Man vil sekvensere både genomet og transkriptomet til parasitten basert på prøver både fra laks (pseudobrankier) og sluttvert. Det vil legges særlig vekt på å optimalisere gode metoder for oppkonsentrering og rensing av myxosporer (f.eks. Percoll-sentrifugering) for å oppnå DNA fra P. pseudobranchicola av høy konsentrasjon. Prøvene vil sekvenseres både med Illumina og PacBio-sekvensering og deretter vil de analyseres med bioinformatiske verktøy.
Markører for å studere forskjellige genetiske varianter vil deretter blir utviklet og brukt på vevsprøver innhentet gjennom prosjektet og prøver som allerede finnes i samlingene til prosjektdeltakerne. qPCR-analyser for påvisning av de forskjellige variantene kan bli utviklet og optimalisert for bruk i andre arbeidspakker og for diagnostikk og miljø-DNA-analyser.
Følgende formidling er planlagt:
• Presentasjon av prosjektresultater på Frisk Fisk 2025 (evt. Frisk Fisk 2027) og Havbruk 2026 og eventuelt på dialogmøter i regi av FHF.
• 2–3 publikasjoner i vitenskapelige tidsskrifter med fagfellevurdering (2025/2027).
• Presentasjon eller poster på European Association of Fish Pathologists (EAFP)-konferansen i Hellas, september 2025 og EAFP i 2027.
• Populærvitenskapelig artikkel i Norsk Fiskeoppdrett.