Prosjektnummer
901942
Forbedring av biosikkerhetstiltak og metoder for påvisning av Renibacterium salmoninarum for å forhindre spredning av bakteriell nyresykdom i lakseoppdrett / Enhancing biosecurity measures and detection of Renibacterium salmoninarum to prevent the spread of bacterial kidney disease in salmonid farming (BKDsafeguard)
Dette prosjektet vil gi industrien innsikt i to viktige aspekter ved bakteriell nyresykdom:
1) tidlig påvisning av agens i infisert fisk og produksjonsmiljø
2) tiltak for å redusere risikoen for smittespredning ved brønnbåttransport eller via annet utstyr brukt til å håndtere fisk
Bakteriell nyresykdom (BKD) er en bakteriesykdom forårsaket av Renibacterium salmoninarum (R. salmoninarum) som forekommer hos laksefisk over hele verden. I Norge er sykdommen meldepliktig (kategori F). De fleste påviste utbruddene har forekommet i Vest-Norge hvor flere elver mest sannsynlig har infisert villfisk. I 2023 ble det sett en markant økning av BKD, der de fleste sykdomsutbruddene var i produksjonsområde PO6. Det er antatt at infeksjonen spredte seg gjennom transport av infisert fisk og/eller via brønnbåter. På Island har BKD vært kjent siden 1968 og finnes nå endemisk i den ville islandske laksepopulasjonen. I årene 2003–2007 ble millioner av oppdrettsfisk i klekkerier avlivet på grunn av R. salmoninarum-infeksjon, noe som resulterte i store økonomiske tap for fiskeoppdretterne. Flytting av infisert fisk førte til at bakterien ble spredt til 18 av de 40 laksefiskeoppdrettsanleggene som var i drift på Island på den tiden.
R. salmoninarum kan gi akutt dødelighet, hovedsakelig hos yngre fisk, men er vanligvis forbundet med kronisk, snikende sykdom og latente, asymptomatiske infeksjoner av livslang varighet. Alle laksefiskarter er mottakelige for BKD, selv om graden av mottakelighet varierer. BKD kan overføres vertikalt med infisert rogn, og horisontalt gjennom fekal-oral smitte, via hud og øye, og ved eksponering for forurenset fôr og vann. Avføring fra infiserte fisker kan utgjøre en viktig smittekilde for BKD i sjøfasen, ettersom bakteriene kan overleve i flere uker i fiskeavføring og sediment. Horisontal smitte via vann mellom anlegg antas å være begrenset siden R. salmoninarum ikke er i stand til å overleve i frie vannmasser lenger enn en uke. Det har imidlertid blitt rapportert om mulig smitte mellom merder internt i samme anlegg, og mellom ulike anlegg der rømt fisk eller smittet villfisk kan være mulige smittekilder. Ved etablering av infeksjon i villfisk kan disse bli et viktig reservoar for smitte til oppdrettslaks. Flytting av levende fisk mellom anlegg er en kritisk risikofaktor for spredning av sykdom, men slik transport av fisk er en essensiell del av produksjonssyklusen i dagens oppdrett.
Det finnes ingen “gullstandard”-test for å diagnostisere R. salmoninarum-infeksjon i fisk. Bakteriene er relativt enkle å dyrke fra fisk med BKD, men det kan ta flere uker og krever spesielle dyrkningsmedier. Dyrkning kan gi like god eller til og med bedre følsomhet enn PCR-analyse, men RT-qPCR for R. salmoninarum er også rutinemessig i bruk i dag, enten alene eller i kombinasjon med andre metoder.
Forurensede overflater i produksjonsmiljøet kan legge til rette for spredning av mikroorganismer til andre dyr og steder. Slik overføring kan forhindres gjennom rengjøring og desinfeksjon, men biofilmdannelse kan redusere effektiviteten av desinfeksjonsmidler. Forskning indikerer at R. salmoninarum kan danne biofilm på abiotiske overflater, og dette kan ha betydning for hvilke rengjørings- og desinfeksjonsmidler og –prosedyrer som har effekt på bakterien.
Under det nylige BKD-utbruddet i Norge ble R. salmoninarum nesten utelukkende påvist med RT-qPCR i fisk når makroskopiske lesjoner ble observert, selv om det ble testet mye i berørte og nærliggende populasjoner. Dette tyder på at forekomsten av infiserte fisk er svært lav, eller at dagens prøvetakingsteknikker ikke er gode nok til å finne subkliniske bærere. Ettersom subkliniske bærere regnes å være et viktig smittereservoar er det mer sannsynlig at det er prøvetakingsteknikkene som er problemet. R. salmoninarum er en intracellulær bakterie, og det er uklart hvilket vev (og tilhørende prøvetakingsteknikk) som resulterer i best deteksjon av bakteriene i bærerfisk.
På grunn av et økt behov for avlusningsoperasjoner har bruken av brønnbåter til håndtering av fisk økt kraftig de siste 5–10 årene. Bruk av brønnbåter er en kjent risikofaktor for spredning av sykdom i lakseoppdrett, og denne risikoen eskalerer når bruken intensiveres. Selv om det ikke har vært rapportert påvisning av R. salmoninarum i miljøprøver fra brønnbåter under utbruddene i Norge, er det likevel mistanke om at båtene kan fungere som vektorer etter transport av infisert fisk. Dette skyldes vanskeligheter med rengjøring og desinfeksjon av båtene, og man mangler i dag kunnskap om beste praksis for vask- og desinfeksjonsrutiner og egnede verktøy for å verifisere effektiviteten av rengjøringsprosessen. Som del av arbeidet med biosikkerhet er det avgjørende å undersøke hvilken rolle brønnbåter og transportutstyr spiller i smittespredning av BKD.
Hovedmål
Å utvikle rammeverk for effektive biosikkerhetstiltak som hindrer smitteoverføring av BKD.
Å utvikle rammeverk for effektive biosikkerhetstiltak som hindrer smitteoverføring av BKD.
Delmål
1. Å identifisere, kvantifisere, vurdere og sammenstille publisert vitenskapelig kunnskap om biosikkerhetstiltak som brukes for å forhindre forekomst og spredning av BKD og R. salmoninarum-infeksjon hos laksefisk i oppdrett.
2. Å sammenlikne ulike prøvetakingsmetoder og vev for å øke sensitiviteten for påvisning av R. salmoninarum i atlantisk laks i et kontrollert, lavdose smitteforsøk.
3. Å optimalisere prøvetakingsstrategier og analysemetoder for påvisning av R. salmoninarum i oppdrettsanlegg for å sikre sensitiv og effektiv påvisning av bakterien i både fisk og miljø (f.eks. vann og sedimenter).
4. Å undersøke evnen til R. salmoninarum til å danne biofilm og evaluere virkningen av biofilmdannelse på effektiviteten av vaske- og desinfeksjonsprotokoller som brukes i brønnbåter og oppdrettsmiljøer.
5. Å utarbeide og validere standardiserte prosedyrer for optimal vask og desinfeksjon av brønnbåter for å redusere smittespredning.
6. Å validere en hurtigdiagnostisk test for påvisning av R. salmoninarum i fisk og miljøprøver i felt for å kunne reagere tidligere på smitte i fiskegrupper og/eller anlegg.
Tidlig påvisning og forbedret biosikkerhet er avgjørende for å stoppe spredningen av BKD og opprettholde god fiskehelse og -velferd i norsk fiskeoppdrett. Ved å bruke etablerte diagnostiske metoder (hovedsakelig RT-qPCR) vil prosjektet øke sensitiviteten for påvisning av R. salmoninarum fra klinisk og subklinisk infisert fisk gjennom forbedrede prøvetakingsteknikker og påvisning av bakteriene i produksjonsmiljøet. Prosjektet vil også validere en ny diagnostisk hurtigtest basert på LFA-teknologi. Testen kan brukes i felt, og kan dermed gi oppdrettsnæringen et nytt verktøy for tidlig og hurtig påvisning av bakterien.
Den andre delen av prosjektet vil gi industrien økt kunnskap om biosikkerhet i brønnbåttransport og bakteriell overlevelse i produksjonsmiljøet. For å forbedre kontrollen og effektiviteten av rengjøring og desinfeksjon i båtene vil man identifisere områder med økt risiko for utilstrekkelig vask og desinfeksjon (“kritiske kontrollpunkter”) og undersøke nye verktøy for å vurdere hygienen. Disse funnene vil utgjøre grunnlaget for en beskrivelse av beste praksis for hvordan man rengjør og desinfiserer brønnbåter, inkludert beste praksis for påfølgende hygienekontroll utført av fiskehelsepersonell.
Prosjektet er organisert i følgende 6 faglige arbeidspakker (AP-er):
Biofilmer etablert under begge næringsforhold vil bli eksponert for vanlig brukte desinfeksjonsmidler ved ulike konsentrasjoner og eksponeringstider for å vurdere effekten av disse.
AP1: Systematisk litteraturgjennomgang
Leder: Liv Østevik (NMBU)
Innsamling, vurdering og oppsummering av relevant litteratur: Vitenskapelig litteratur som dekker biosikkerhetstiltak for å forhindre forekomst og spredning av BKD og R. salmoninarum-infeksjon i oppdrettet laksefisk og andre fiskearter, samles gjennom strukturerte litteratursøk basert på nøkkelord i vitenskapelige databaser. Den innsamlede litteraturen vil bli kritisk gjennomgått, og resultatene vil bli oppsummert i en vitenskapelig gjennomgangsartikkel og i den endelige vitenskapelige rapporten.
Leder: Liv Østevik (NMBU)
Innsamling, vurdering og oppsummering av relevant litteratur: Vitenskapelig litteratur som dekker biosikkerhetstiltak for å forhindre forekomst og spredning av BKD og R. salmoninarum-infeksjon i oppdrettet laksefisk og andre fiskearter, samles gjennom strukturerte litteratursøk basert på nøkkelord i vitenskapelige databaser. Den innsamlede litteraturen vil bli kritisk gjennomgått, og resultatene vil bli oppsummert i en vitenskapelig gjennomgangsartikkel og i den endelige vitenskapelige rapporten.
AP2: Optimalisering av påvisning og diagnose av R. salmoninarum-infeksjon ved eksperimentell smitte atlantisk laks
Leder: Simen Nørstebø (NMBU)
Leder: Simen Nørstebø (NMBU)
For å oppnå et spekter av infeksjonsnivåer, inkludert subkliniske bærere, vil prosjektet eksponere laks for tre ulike bakteriekonsentrasjoner ved badesmitte. Valg av smittedoser vil ta utgangspunkt i et foregående piloteksperiment. Dette eksperimentet vil også brukes til å optimalisere protokoller for forbehandling av prøver, RT-qPCR og dyrkning. Prøver av ulike substrat (vev og svaber) og organer (hud, gjelle, nyre, osv.) tas til bakteriologisk dyrkning, RT-qPCR, histologi og LFA-hurtigtesten (AP6) ved syv tidspunkter i løpet av de åtte ukene eksperimentet pågår. Dette vil gi mulighet for vurdering av infeksjonsdynamikk og sammenligning av påvisningsrater ved bruk av ulike prøvematerialer og diagnostiske tester i løpet av infeksjonen. Målet er å undersøke hvilke prøvematerialer, teknikker og diagnostiske tester som kan øke påvisningsraten av R. salmoninarum ved forskjellige infeksjonsnivåer hos fisken. Miljøprøver (vann, avføring/sediment, biofilm) fra karmiljøet vil også bli analysert ved dyrkning, RT-qPCR og hurtigtesten for å undersøke bakterienes overlevelse i miljøet, og for å undersøke utskillelsen av R. salmoninarum ved ulike stadier av infeksjonen.
Dersom R. salmoninarum blir påvist i miljøprøver i løpet av forsøket vil det tas ut prøver fra ett kar i ytterligere seks uker. Analyser av disse prøvene vil gi informasjon om bakteriens overlevelse i miljøet og R. salmoninarum sin evne til å danne biofilm, noe som man også vil undersøke videre i AP4.
AP3: Optimalisering av prøvetakingsstrategier og analyse av R. salmoninarum i lakseanlegg på land
Leder: Bernharð Laxdal (VETAQ – Aquatic veterinary service)
Leder: Bernharð Laxdal (VETAQ – Aquatic veterinary service)
Infeksjonsdynamikk for R. salmoninarum i felt vil undersøkes ved å ta prøver fra et landbasert gjennomstrømmingsanlegg på Island og om mulig i forbindelse med utbrudd hos produsenten Lerøy i Norge. BKD ble diagnostisert i ett av den islandske oppdretteren Samherjis anlegg i 2017, og det har siden vært sporadiske utbrudd av BKD. Prøvetakingen i anlegget på Island kommer starte med en screening i flere avdelinger, i tillegg til å følge inntil 3 fiskegrupper med regelmessig prøvetaking gjennom prosjektperioden. Ved eventuell påvisning av smitte intensifieres prøvetakingen for å følge smittedynamikken under feltforhold. Ulike vevs- og svaberprøver (hud, gjelle, nyre etc.) vil bli tatt ut for RT-qPCR, bakteriologi, hurtigtest og histologi. Hvilke prøver og organer som skal analyseres vil bli veiledet av resultatet i AP2. Miljøprøver fra ulike produksjonsområder, inkludert tankvegger, utstyr i og rundt tankene, trommelfiltre, filterutløpsvann fra R. salmoninarum-positive tanker og prøve av alle inntakskilder til vann eller vannfiltrering osv., vil bli analysert (RT-qPCR) og evaluert for påvisning av R. salmoninarum.
Ved eventuelt utbrudd i Norge kommer infiserte fiskegrupper følges opp.
AP4: Evaluering av effekten av biofilmformasjon på effektiviteten av vask- og desinfeksjonsprotokoller i brønnbåter og oppdrettsanlegg
Leder: Letemichael Negash Welekidan (NMBU)
Leder: Letemichael Negash Welekidan (NMBU)
Desinfeksjonseffektivitetstestene vil følge retningslinjene fra det norske miljødirektoratet og vil involvere både planktoniske (frittflytende) bakterier og bakterier i biofilm. For å vurdere og karakterisere bakteriens evne til å danne biofilm under varierende næringsforhold, vil man inokulere R. salmoninarum i næringsrike og næringsfattige medium. Effekten av saltholdighet på biofilmformasjon vil også bli vurdert ved å sammenligne sjøvann med ferskvann. Den totale biofilm-biomassen vil bli målt, andelen levende/døde celler innenfor biofilmstrukturen bli bestemt og strukturen i biofilmfellesskapet over tid vil bli overvåket og beskrevet.
Biofilmer etablert under begge næringsforhold vil bli eksponert for vanlig brukte desinfeksjonsmidler ved ulike konsentrasjoner og eksponeringstider for å vurdere effekten av disse.
Desinfeksjonsmidlene som viser seg effektive mot R. salmoninarum i laboratorieeksperimentene, vil bli testet i en mer praktisk setting ved bruk av tankene som brukes i den eksperimentelle utfordringen (AP2). Ved slutten av utfordringseksperimentet vil to kar bli rigget for å teste effektiviteten av desinfeksjonsmidler. En av de to karene vil gjennomgå rengjøring med vaskemidler for å fjerne eventuelle sedimenter, organiske materialer og biofilmformasjon som potensielt kan påvirke effektiviteten av desinfeksjonsmidler. Begge karene (rengjort og uvaskede) vil deretter bli desinfisert under samme forhold som laboratorieeksperimentet. Prøver for dyrkning vil tas før og etter vask og på ulike tidspunkt etter desinfeksjon for å vurdere effektiviteten av desinfeksjonsmidlene på både rengjorte og uvaskede kar. Desinfeksjonsmidler viser seg effektive i forsøkene over vil bli testet i et oppdrettsmiljø hos Samherji på Island (AP 3) for å etablere retningslinjer for beste praksis for rengjøring og desinfeksjon.
AP5: Beste praksis for rengjøring og desinfeksjon av brønnbåter for å redusere risikoen for spredning av sykdom
Leder: David Persson (NMBU)
Leder: David Persson (NMBU)
Opptil fire båter (avhengig av båtdesign og tilgjengelighet) vil bli brukt i denne arbeidspakken. Ved hjelp av 16S rRNA-ampliconsekvensering vil man forsøke å identifisere indikatorbakterier som kan brukes til å evaluere effekten brønnbåtvask og desinfeksjon. Prøver vill bli tatt før og etter vask og desinfeksjon og artssammensetningen av mikroorganismer i brønnbåtene skal kartlegges og beskrives.
Kritiske kontrollpunkter i brønnbåter skal beskrives ved undersøkelse av 2–3 brønnbåter med ulike design. Områder med fare for utilstrekkelig rengjøring skal identifiseres ved hjelp av en riboflavintest der riboflavin (fluorescerende væske) påføres innsiden av brønnbåten før rutinemessig vask. Deretter brukes UV-lys og kameraundersøkelse av rør og ventiler for å oppdage områder som ikke er tilstrekkelig rengjort – hvilket danner grunnlaget for å beskrive kritiske kontrollpunkter i brønnbåten og undersøkt videre. Disse kritiske kontrollpunktene og risikoområder (som filtre og luftesystemer), vil bli testet før og etter rengjøring (inkludert trinnet mellom vask og desinfeksjon) for å evaluere effekten mellom trinnene i rengjøringsprosessen. ATP-målinger og rRNA-ampliconsekvensering vill bli brukt.
Basert på funnene i dette prosjektet og kunnskapen i prosjektgruppen, vil det formuleres en beste praksis for hvordan man rengjør og desinfiserer brønnbåter. Den norske veterinærforeningen har utviklet en veiledning for hvordan man utfører hygienekontroller i brønnbåter. Et viktig mål er å gi fiskehelsepersonell og bransjen en standard for hvordan man utfører disse kontrollene. Resultatene fra dette prosjektet skal brukes til å utarbeide en revidert og oppdatert veileder i samarbeid med Veterinærforeningen.
AP6: Validering av en diagnostisk hurtigtest for påvisning av R. salmoninarum
Leder: Marina Alexeeva (Nordicdx AS)
Leder: Marina Alexeeva (Nordicdx AS)
Valideringen av den diagnostiske testen starter med å optimalisere LFA-testen for å være kompatibel med iaX-optisk leser. Videre blir hurtigtesten kalibrert mot Pharmaq Analytiq sin RT-qPCR med hjelp av en fortynningsserie av bakterier fra renkultur som en in vitro-validering. In vivo-validering vil gjennomføres ved å bruke prøver fra fisk smittet av R. salmoninarum, bekreftet gjennom positive resultater ved RT-qPCR-analyse. De kvantitative resultatene av hurtigtesten vil bli sammenlignet med referanse-RT-qPCR-resultatene. Kun én prøvetype vil bli brukt i denne oppgaven, og valg av prøvetype vil bli veiledet av resultatene fra AP2 og 3. Hurtigtesten vil valideres i felt ved bruk av positive miljøprøver, samt ulike prøver fra BKD-infiserte fisk. De kvantitative resultatene vil bli sammenlignet med PHARMAQ Analytiqs RT-qPCR-test for å vurdere nøyaktigheten og påliteligheten til hurtigtesten i feltforhold. Statistiske analyser vil bli utført for å vurdere samsvar og samvariasjon mellom resultatene fra hurtigtesten og RT-qPCR-analyse. Sensitiviteten, spesifisiteten og prediktive verdier for hurtigtesten vil undersøkes. I tillegg vil resultatene for de ulike analysemetodene for ulike prøvetyper vurderes.
Beste praksis/retningslinjer for prøvetaking og diagnostikk av R. salmoninarum-infeksjon, rengjøring og desinfeksjon av brønnbåter og hygienekontroll av brønnbåter vil bli publisert på norsk og engelsk, sammen med video-materiale som viser de viktigste aspektene i retningslinjene. Retningslinjene vil være målrettet mot næringen og resultatene vil bli publisert på prosjektpartnernes og FHFs nettsteder, sammen med andre relevante informasjonskanaler i bransjen (f.eks. brønnbåtveiledere.no).
Resultatene vil også presenteres muntlig på relevante seminarer og konferanser (for eksempel konferansen Havbruk), samt skriftlig i populærvitenskapelige medier (for eksempel Norsk fiskeoppdrett) og form av fire planlagte vitenskapelige artikler. Den vitenskapelige sluttrapporten vil bli skrevet på norsk.
Resultatene vil også presenteres muntlig på relevante seminarer og konferanser (for eksempel konferansen Havbruk), samt skriftlig i populærvitenskapelige medier (for eksempel Norsk fiskeoppdrett) og form av fire planlagte vitenskapelige artikler. Den vitenskapelige sluttrapporten vil bli skrevet på norsk.