Prosjektnummer
901918
Utvikling av CRISPR baserte in vitro systemer for å redusere bruken av smitteforsøk i akvakultur/ CRISPR-screening to reduce challenge testing in aquaculture (PETRI-FISH)
Infeksiøs lakseanemi (ILA) er en alvorlig og smittsom virussykdom som potensielt medfører stor dødelighet hos den infiserte fisken og utgjør et betydelig problem hos oppdrettsnæringen i Norge og andre land. Dessverre finnes det i dag ikke noen fullstendig effektiv behandling eller vaksine for sykdommen. En rekke studier har påvist stor genetisk variasjon i motstandsdyktighet for ILA og genombasert avl er i dag et viktig virkemiddel for sykdomsforebygging.
“CRISPR-screening” er et kraftig verktøy for å detektere gener som påvirker sykdommer. Metoden er godt etablert hos mennesker og mus der man har oppdaget en rekke gener involvert i kreftutvikling. Videre har man brukt metodikken til å studere vert-patogen-interaksjoner for Sars-CoV-2, dengue og zikavirus, norovirus og HIV, for å nevne noen. Metodikken øker i popularitet og forsøkes nå etablert også for tradisjonelle husdyr og fisk.
Det primære målet med PETRI-FISH-prosjektet er å utvikle og anvende “CRISPR-screening” for å redusere smittetesting av levende fisk i akvakultur. Metodikken vil bli etablert for å detektere gener og signalveier som er involvert i resistens og mottakelighet for infeksiøs lakseanemi hos atlantisk laks.
Forskerne involvert i PETRI-FISH har tidligere samarbeidet i prosjektet “Utvikle innovative løsninger for norsk avlsindustri ved bruk av genredigering (GENEinnovate)” (Forskningsrådets prosjektnr: 281928), som ble avsluttet i 2023). I det prosjektet utviklet man “CRISPR-screening” for å studere respons på α-hemolysin toksin i gris og Bovine Viral Diarrhea Virus (BVDV) i storfe. Arbeidet har blitt fulgt opp i prosjektet “Presisjonsavl for virusresistense” (Forskningsrådets prosjektnr: 321428)”, som ledes av AquaGen. Det prosjektet har som hovedformål å levere lakseyngel med forbedret sykdomsresistens mot IPN-viruset.
PETRI-FISH vil gå lenger enn å bare levere protokoller, men også bruke teknologien til å undersøke gener som ligger til grunn for resistens og mottakelighet for ILA-viruset, som i dag utgjør et betydelig problem innen norsk akvakultur. Metodikk, ressurser og kompetanse utviklet i prosjekter er i stor grad overførbart til andre sykdommer i akvakultur, noe som ytterligere vil kunne redusere behovet for sykdomstesting av levende dyr.
“CRISPR-screening” er et kraftig verktøy for å detektere gener som påvirker sykdommer. Metoden er godt etablert hos mennesker og mus der man har oppdaget en rekke gener involvert i kreftutvikling. Videre har man brukt metodikken til å studere vert-patogen-interaksjoner for Sars-CoV-2, dengue og zikavirus, norovirus og HIV, for å nevne noen. Metodikken øker i popularitet og forsøkes nå etablert også for tradisjonelle husdyr og fisk.
Det primære målet med PETRI-FISH-prosjektet er å utvikle og anvende “CRISPR-screening” for å redusere smittetesting av levende fisk i akvakultur. Metodikken vil bli etablert for å detektere gener og signalveier som er involvert i resistens og mottakelighet for infeksiøs lakseanemi hos atlantisk laks.
Forskerne involvert i PETRI-FISH har tidligere samarbeidet i prosjektet “Utvikle innovative løsninger for norsk avlsindustri ved bruk av genredigering (GENEinnovate)” (Forskningsrådets prosjektnr: 281928), som ble avsluttet i 2023). I det prosjektet utviklet man “CRISPR-screening” for å studere respons på α-hemolysin toksin i gris og Bovine Viral Diarrhea Virus (BVDV) i storfe. Arbeidet har blitt fulgt opp i prosjektet “Presisjonsavl for virusresistense” (Forskningsrådets prosjektnr: 321428)”, som ledes av AquaGen. Det prosjektet har som hovedformål å levere lakseyngel med forbedret sykdomsresistens mot IPN-viruset.
PETRI-FISH vil gå lenger enn å bare levere protokoller, men også bruke teknologien til å undersøke gener som ligger til grunn for resistens og mottakelighet for ILA-viruset, som i dag utgjør et betydelig problem innen norsk akvakultur. Metodikk, ressurser og kompetanse utviklet i prosjekter er i stor grad overførbart til andre sykdommer i akvakultur, noe som ytterligere vil kunne redusere behovet for sykdomstesting av levende dyr.
Hovedmål
Å utvikle in vitro-systemer for å minimere bruken av forsøksfisk til påvisning av resistens mot virussykdommer. For å lykkes i dette arbeidet vil man bygge på erfaring fra “CRISPR-screening” i tradisjonelle husdyr (ku og gris) og tilpasse metodikk til laksefisk.
Delmål (med korresponderende arbeidspakker (AP-er))
1. Å karakterisere eksisterende og nye cellelinjer og evaluere deres nytte for in vitro-testing av sykdom i laksefisk.
2. Å optimalisere eksperimentelle forhold for å maksimere effektiviteten av transduksjon i lakse-cellelinjer.
3. Å designe ulike biblioteker som øker effektiviteten og presisjonen til CRISPR-screeningbiblioteker i laksefisk.
4. Å avsløre gener og/eller veier involvert i resistens og mottakelighet for ISAV hos laksefisk.
Å utvikle in vitro-systemer for å minimere bruken av forsøksfisk til påvisning av resistens mot virussykdommer. For å lykkes i dette arbeidet vil man bygge på erfaring fra “CRISPR-screening” i tradisjonelle husdyr (ku og gris) og tilpasse metodikk til laksefisk.
Delmål (med korresponderende arbeidspakker (AP-er))
1. Å karakterisere eksisterende og nye cellelinjer og evaluere deres nytte for in vitro-testing av sykdom i laksefisk.
2. Å optimalisere eksperimentelle forhold for å maksimere effektiviteten av transduksjon i lakse-cellelinjer.
3. Å designe ulike biblioteker som øker effektiviteten og presisjonen til CRISPR-screeningbiblioteker i laksefisk.
4. Å avsløre gener og/eller veier involvert i resistens og mottakelighet for ISAV hos laksefisk.
Prosjektet skal levere teknologiske løsninger, ressurser og kunnskap som bidrar til å redusere sykdomstesting av levende fisk for påvisning av resistens mot ILA-virus. Dette vil kunne redusere bruken av dyreforsøk i akvakultur, redusere kostnader og forbedre framtidig bærekraft i næringen.
Verktøyene som utvikles (CRISPR-biblioteket, protokoller for transduksjon, cellelinjer etc.), vil kunne brukes til å undersøke andre patologier som kan modelleres in vitro, for eksempel virus og bakterielle infeksjoner og toksisk eksponering.
Dersom regelverket endres til å tillate bruk av genredigering i kommersiell akvakultur, kan informasjon om resistensgener og mekanismer i prosjektet brukes til praktisk anvendelse ved hjelp av denne teknologien. Dette kan potensielt gi store forbedringer i helse og velferden til fisken. Deteksjon av spesifikke gener og funksjonelle elementer involvert i sykdomsrespons kan også lede til utvikling av vaksine- og/eller medikamentbehandling som gir bedre fiskehelse.
Verktøy og kunnskap utviklet i PETRI-FISH vil bli formidlet via vitenskapelige publikasjoner og i møter/konferanser for å støtte innovasjon i industrien.
Verktøyene som utvikles (CRISPR-biblioteket, protokoller for transduksjon, cellelinjer etc.), vil kunne brukes til å undersøke andre patologier som kan modelleres in vitro, for eksempel virus og bakterielle infeksjoner og toksisk eksponering.
Dersom regelverket endres til å tillate bruk av genredigering i kommersiell akvakultur, kan informasjon om resistensgener og mekanismer i prosjektet brukes til praktisk anvendelse ved hjelp av denne teknologien. Dette kan potensielt gi store forbedringer i helse og velferden til fisken. Deteksjon av spesifikke gener og funksjonelle elementer involvert i sykdomsrespons kan også lede til utvikling av vaksine- og/eller medikamentbehandling som gir bedre fiskehelse.
Verktøy og kunnskap utviklet i PETRI-FISH vil bli formidlet via vitenskapelige publikasjoner og i møter/konferanser for å støtte innovasjon i industrien.
Prosjektet er oganisert i følgende arbeidspakker (AP-er):
1. Etablere og karakterisere en rekke cellelinjer for laksefisk
Dagens ressurser for cellearbeid på laksefisk er begrenset sammenliknet med andre arter, og med tanke på genredigering, dårlig karakterisert. I denne arbeidspakken vil man samle inn eksisterende cellelinjer fra laksefisk og systematisk karakterisere deres mottakelighet for patogener, hvor mulig det er gjennomføre viral transduksjon, deres følsomhet for antibiotika osv. I tillegg vil en bruke ulike isoleringsteknikker, medietilsetninger og flow-cytometri for å utvikle nye cellelinjer fra ulike vev og embryoer.
Optimalise protokoller for “CRISPR-screening” i atlantisk laks og coho
Lentiviral transduksjon er teknikken prosjektgruppen vil bruke for å generere tusenvis av CRISPR-redigeringer i millioner av celler in vitro, slik at hver celle har én unik genredigering. Denne teknikken har vist seg å være svært effektiv i mange pattedyrcellelinjer. For laks derimot er effektiviteten lav, og den må derfor forbedres for å gjøre storskala screening praktisk mulig. Ved hjelp av celler fra atlantisk laks og coho vil man teste tre ulike metoder for å forbedre virusinfeksjonen, der en bruker GFP som en markør for suksess. Homogene populasjoner av GFP-uttrykkende celler vil deretter bli brukt som targets i en oppfølgende transduksjon med lentivirus der man bruker CRISPR-verktøy for å slå ut GFP.
Designe biblioteker for“CRISPR-screening” rettet mot gener og funksjonelle elementer i atlantisk laks og coho
Dagens prinsipper og verktøy for design av CRISPR-screeningbiblioteker er utviklet basert på data fra menneske- og/eller mus. Bruken av disse verktøyene på andre arter, spesielt fjernt beslektede arter, har vist seg å være mindre vellykket. Prosjektgruppens tidligere erfaring med å bruke designverktøy på andre organismer enn modellorganismer (storfe og gris) og kunnskap om laksens genom vil bli brukt til å utvikle CRISPR-screeningbiblioteker i atlantisk laks og coho. Man vil trene opp prosjektgruppens designverktøy til å konstruere et bibliotek som inneholder mange CRISPR-guider rettet mot noen få gener, og generere eksperimentelle data for å designe optimale guideegenskaper. Basert på resultater fra de innledende arbeidene vil man i neste omgang konstruere biblioteker rettet mot gener og funksjonelle elementer i både atlantisk laks og Coho-laks.
Utvikle en ISAV fenotype og utføre genomvis screening og validering av effekter
Cellelinjer fra atlantisk laks og coho vil bli testet med ulike tettheter med forskjellige doser av ILAV. Disse er tilgjengelig internt og representerer den høypolymorfe regionen (HPR)-deleterte stamen. Effekten av behandlingen vil bli evaluert med hensyn til virusbelastning og celleoverlevelse. Målet er å identifisere grunnleggende infeksjonsbetingelser og metoder for fenotyping. Senere vil transduksjon med av celler med ulike CRISPR-bibliotek fra begge arter bli testet ut med ulike virusdoser for å finne ut hvilke genendringer som gjør cellene mer mottakelige ved lav virusbelastning og hvilke som gir resistens ved høy belastning. Kandidatgenene påvist i disse forsøkene vil bli validert i mer omfattende in vitro-testing.
1. Etablere og karakterisere en rekke cellelinjer for laksefisk
Dagens ressurser for cellearbeid på laksefisk er begrenset sammenliknet med andre arter, og med tanke på genredigering, dårlig karakterisert. I denne arbeidspakken vil man samle inn eksisterende cellelinjer fra laksefisk og systematisk karakterisere deres mottakelighet for patogener, hvor mulig det er gjennomføre viral transduksjon, deres følsomhet for antibiotika osv. I tillegg vil en bruke ulike isoleringsteknikker, medietilsetninger og flow-cytometri for å utvikle nye cellelinjer fra ulike vev og embryoer.
Optimalise protokoller for “CRISPR-screening” i atlantisk laks og coho
Lentiviral transduksjon er teknikken prosjektgruppen vil bruke for å generere tusenvis av CRISPR-redigeringer i millioner av celler in vitro, slik at hver celle har én unik genredigering. Denne teknikken har vist seg å være svært effektiv i mange pattedyrcellelinjer. For laks derimot er effektiviteten lav, og den må derfor forbedres for å gjøre storskala screening praktisk mulig. Ved hjelp av celler fra atlantisk laks og coho vil man teste tre ulike metoder for å forbedre virusinfeksjonen, der en bruker GFP som en markør for suksess. Homogene populasjoner av GFP-uttrykkende celler vil deretter bli brukt som targets i en oppfølgende transduksjon med lentivirus der man bruker CRISPR-verktøy for å slå ut GFP.
Designe biblioteker for“CRISPR-screening” rettet mot gener og funksjonelle elementer i atlantisk laks og coho
Dagens prinsipper og verktøy for design av CRISPR-screeningbiblioteker er utviklet basert på data fra menneske- og/eller mus. Bruken av disse verktøyene på andre arter, spesielt fjernt beslektede arter, har vist seg å være mindre vellykket. Prosjektgruppens tidligere erfaring med å bruke designverktøy på andre organismer enn modellorganismer (storfe og gris) og kunnskap om laksens genom vil bli brukt til å utvikle CRISPR-screeningbiblioteker i atlantisk laks og coho. Man vil trene opp prosjektgruppens designverktøy til å konstruere et bibliotek som inneholder mange CRISPR-guider rettet mot noen få gener, og generere eksperimentelle data for å designe optimale guideegenskaper. Basert på resultater fra de innledende arbeidene vil man i neste omgang konstruere biblioteker rettet mot gener og funksjonelle elementer i både atlantisk laks og Coho-laks.
Utvikle en ISAV fenotype og utføre genomvis screening og validering av effekter
Cellelinjer fra atlantisk laks og coho vil bli testet med ulike tettheter med forskjellige doser av ILAV. Disse er tilgjengelig internt og representerer den høypolymorfe regionen (HPR)-deleterte stamen. Effekten av behandlingen vil bli evaluert med hensyn til virusbelastning og celleoverlevelse. Målet er å identifisere grunnleggende infeksjonsbetingelser og metoder for fenotyping. Senere vil transduksjon med av celler med ulike CRISPR-bibliotek fra begge arter bli testet ut med ulike virusdoser for å finne ut hvilke genendringer som gjør cellene mer mottakelige ved lav virusbelastning og hvilke som gir resistens ved høy belastning. Kandidatgenene påvist i disse forsøkene vil bli validert i mer omfattende in vitro-testing.
Hovedmålgrupper for formidling er akademia (forskere og studenter innen akvakultur, bioteknologi, genetikk og genomikk) og aktører innen oppdrettsnæringene (inkludert ledelse og FoU-avdelinger). Formidling av resultater av høy faglig kvalitet er en prioritet i dette prosjektet. Etter første utgivelse som preprints på bioRxiv vil man publisere resultatene i anerkjente vitenskapelige tidsskrifter med åpen publisering.
Videre vil aktiviteter og resultater bli formidlet på relevante konferanser og møter der relevant industri er representert. Det vil også lages pressemeldinger gjennom media som The FishSite, og formidle resultater til bredere grupper i samfunnet, frivillige organisasjoner, politikere og andre beslutningstakere. I denne formidlingen vil man vektlegge kunnskapsutveksling, økt generell bevissthet og åpenhet.
Videre vil aktiviteter og resultater bli formidlet på relevante konferanser og møter der relevant industri er representert. Det vil også lages pressemeldinger gjennom media som The FishSite, og formidle resultater til bredere grupper i samfunnet, frivillige organisasjoner, politikere og andre beslutningstakere. I denne formidlingen vil man vektlegge kunnskapsutveksling, økt generell bevissthet og åpenhet.