Kartlegging av raffinert makrellolje til humant konsum: Positive og negative helseeffekter ved inntak av raffinert makrellolje

Del 1
Utvalgte relevante fremmedstoffer vil bli kvantifisert i den fremstilte oljen før den testes i dyreforsøket. Opparbeidelse og deteksjonsmetoden vil variere litt avhengig av analytt, men de fleste fremmedstoffene vil kvantifiseres ved hjelp av gasskromatografi-massespektrometri (GC-MS). I tillegg til fremmedstoffanalyser vil lipidklasser bestemmes ved hjelp av tynnsjiktkromatografi (High performance thin layer chromatograophy- (HPTLC) og fettsyresammensetning i nøytral og polar lipidfraksjon ved hjelp av Ultra Fast gasskromatografi (UFGC). Vitamin A, D og E bli analysert med henholdsvis high performance liquid chromatography (HPLC), HPLC-UV og HPLC-fluorescens. Målingene i rå- og raffinert makrellolje vil bli gjennomført på NIFES og metodene som benyttes er akkrediterte for analyser i fisk, fiskeprodukter og marine oljer. Etter at karakteriseringen av en “kalibrert” olje er gjennomført, vil det være nødvendig med en kartlegging av oksidasjonsgrad (harskning). Analyser som gir en indikasjon på eventuell oksidasjon vil bli gjennomført, deriblant peroksidtall (PV), anisidintall (AV) og frie fettsyrer, som er de offisielle metodene for måling av oksidasjon i oljer. PV kvantifiserer primære oksidasjonsprodukter (uten lukt, farge og smak), mens sekundære oksidasjonsprodukter kvantifiseres ved å måle AV. Nivå av frie fettsyrer gir en indikasjon på hvor langt en eventuell hydrolyse av triglyseridene har kommet. Oksidasjonsgrad vil bli målt i oljen umiddelbart etter raffinering, men i tillegg er det ønskelig med målinger av oksidasjonsgrad ved lagring. For å kunne si noe om oksidasjonsgrad ved lagring vil det bli alikvotert ti prøver etter raffinering, og oksidasjon vil bli undersøkt etter 6, 12 og 24 måneder ved lagring på -20 °C i mørket. Det antas at grad av oksidasjon er lite endret etter 6 og 12 måneder, men basert på tidligere undersøkelser tror man at grad av oksidasjon vil være noe økt etter 24 måneder. I tillegg vil grad av oksidasjon bli undersøkt ved lagring i romtemperatur (20 °C ± 1), for å fremskynde oksidasjonsprosessen, og prøver vil bli analysert etter 3, 6 og 12 måneders lagring. Analyser knyttet til oksidasjon vil bli gjennomført av Møreforsking AS, på bakgrunn av at dette er analyser som de gjennomfører regelmessig, og at en sammenligning av resultater med tidligere forsøk blir lettere og mer troverdig. Utvikling av oksidasjon forekommer i alle oljer, men utviklingen kan bremses ved riktig prosessering og lagring. Grad av oksidasjon og smak har vist å ha en god sammenheng, og derfor vil det være helt nødvendig med sensoriske analyser av den raffinerte makrelloljen. Kriteriene som vil bli vurdert er lukt, smak og utseende, og vil bli gjennomført av et trent panel. Testen er utformet som en kvalitetskontrolltest og innebærer at den raffinerte makrelloljen testes mot en kontrollolje. Hver olje vil bli gitt en totalscore basert på lukt, smak og utseende. Avvik fra kontrolloljen vil kvantifiseres fra 0 til 5, hvor 5 er mest avvikende fra referanseoljen. Sensoriske analyser vil blir gjennomført av Møreforsking AS, som har personell med erfaring innen sensoriske analyser av fisk og fiskeprodukter. Dommerpanelet vil bestå av mellom 4–6 personer og disse vil være “blindet” når oljene skal testes.

Del 2
Det er ønskelig å gjennomføre to dyreforsøk med gnagere av typen C57BL/6J-mus, som vil danne grunnlaget for en vurdering av eventuelle negative og positive helseeffekter ved konsum av raffinert makrellolje.

Den første delen vil være et standard eksponeringsforsøk for testing av kjemikalier i samsvar med OECD sine retningslinjer (test 408), som vil gi informasjon om mulige helseskadelige effekter ved inntak av raffinert makrellolje over en lengre periode. Dyrene vil blir gitt makrellolje i dietten i 90 dager, og forsøket vil gi informasjon om toksiske effekter og akkumulering av fremmedstoffer i utvalgte organer. I tillegg til å gi informasjon om eventuelle toksiske effekter vil forsøket gi et estimat av ikke-observerte ugunstige virkninger på ønsket eksponeringsnivå. Et dyreforsøk i samsvar med OECD sine retningslinjer vil etablere sikkerhetskriterier for humant konsum av raffinert makrellolje. Forsøket vil være utformet som en “benchmark test” (yteprøve) med sammenligning mot andre fiskeoljer med bedre kartlagte fysiologiske egenskaper. En “benchmark test” er helt nødvendig for å avklare raffinert makrellolje sin posisjon i markedet, og vil gi informasjon om hva som skiller raffinert makrellolje fra andre marine oljer når det gjelder fysiologiske helseeffekter ved konsum. Raffinert makrellolje vil bli blandet inn i en lav fett/chow-diett bestående av totalt 10–12 prosent fett. Makrellolje vil bli innblandet i 3 ulike konsentrasjoner (100 %, 50 % og 25 % utbytte), og vil bli sammenlignet mot en standard kontrolldiett bestående av soya- og maisolje. Total eksponeringstid vil være 90 dager, og det vil bli gjennomført en makro- og histologisk eksaminering av lever, nyrer, milt og fordøyelsessystemet ved terminering. I tillegg vil det bli målt spesifikke markører for leverskade blant annet aspartat-aminotransferase (ASAT), alanin aminotransferase (ALAT), C-reaktivt protein (CRP) og gammaglutamyltranspeptidase (Gamma-GT). I tillegg vil inflammasjon i plasma og godt etablerte markører (på mRNA-nivå) for toksisitet bli kvantifisert i lever.

Det andre dyreforsøket vil se nærmere på positive helseeffekter ved konsum av makrellolje. Man vil benytte en vestlig diett (WD)- med ca. 20 gram fett per 100 g (hvorav 33 % vegetabilske oljer, 33 % melkefett og 33 % lard/smult). En ønsker å benytte dietter med henholdsvis 33 % og 16,5 % utbytte av fettet i dietten (lard/smult) med makrellolje. Man vil også inkludere en gruppe som blir gitt en WD kontrolldiett som er uendret med hensyn til fettkildene. Inntak av fiskeoljer har tidligere blitt dokumentet å ha en anti-inflammatorisk effekt ved å måle generelle betennelsesmarkører i kroppen. Vi ønsker i dette forsøket å undersøke om regelmessig inntak av raffinert makrellolje har en betennelsesdempende effekt spesifikt i tarm- og fordøyelsessystemet. En betennelsesreaksjon vil fremkalles ved å injisere lipopolysakkarider (LPS) i halvparten av musene rett før terminering. LPS finnes i gram-negative bakterier, og en injeksjon vil starte en akutt immunologisk respons i dyrene, og måten LPS administreres på vil gi størst immunologisk respons i mage- og tarmkanalen. Inflammasjon vil kvantifiseres ved å måle spesifikke markører for inflammasjon på mRNA og protein-nivå, deriblant Interleukin-6 (IL-6) og Tumor nekrose-faktor alfa (TNF-α). En ønsker i dette prosjektet å undersøke om inntak av makrellolje, over en lengre periode, kan ha en betennelsesdempende effekt på mage/tarmkanalen, som vil være veldig relevant for det økende antall personer med kroniske mage/tarm-problemer i Norge og verden generelt. Forsøket vil også gi indikasjoner på om raffinert makrellolje har en preventiv effekt på utvikling av overvekt- og fedmerelaterte sykdommer.

 

I tilknytning til FINS-prosjektet, der NIFES har en sentral rolle, ble det sett en positiv sammenheng mellom konsum av makrell og utvikling av kognitiv kapasitet hos barnehagebarn. For å kartlegge eventuelle positive kognitive effekter ved inntak av makrellolje vil det være nødvendig å undersøke grad av inkorporering av EPA og DHA fra makrellolje i hjernen ved inntak av ulike konsentrasjoner i dietten. Ved å gjøre et fôringsforsøk i mus så har man muligheten til å måle konsentrasjonen av EPA, DHA og andre fettsyrer i ulike hjernehalvdeler fra mus gitt raffinert makrellolje i dietten over en lengre periode. Dette gir en mulighet til å kvantifisere grad av inkorporering av EPA og DHA i forhold nivået musene blir gitt i diettene.