Prosjektnummer
900919
Dokumentasjon av biotilgjengelighet for bioaktive peptider
Biotilgjengeligheten ble målt i blodprøver fra forsøksdyr, og tripeptidet FSY ble brukt som modellpeptid. Forsøksdyrene ble fastet i 4 timer før de ble sondefôret med 100 mg/kg FSY suspendert i vann. Etter 15–60 minutter ble blod ekstrahert ved tapping direkte fra hjertet til hepariniserte rør som så ble sentrifugert for å lage plasma. Prøver av aorta ble klippet ut og homogenisert. Plasma og aorta-materiale ble denaturert med Gu-SCN før syrefelling av proteiner med TCA. Supernatanten ble filtrert og tilsatt en kjent mengde 13C-FSY som internstandard før den ble ekstrahert på en fast fase kolonne. Etter ekstraksjon ble prøven analysert ved hjelp av liquid chromatography mass spectrometry, LC-MS. Mengden FSY i prøven ble deretter bestemt semikvantitativt gjennom forholdet mellom FSY og 13C-FSY.
3 milepæler ble satt for prosjektet:
3 milepæler ble satt for prosjektet:
Milepæl 1 var å undersøke om FSY lot seg måle i blodplasma. Dette ble oppnådd ved å tilsette FSY til plasma og deretter detektere FSY ved hjelp av LC-MS.
Milepæl 2 bestod i å fastslå om FSY passerer tarmveggen og absorberes til blod og resultatene viste at ved å administrere en høy konsentrasjon av FSY (100 mg/kg) kunne det detekteres i blodet etter 1 time. En fant derimot ikke FSY i aorta-prøver. Siden metodene ga resultater med til dels store variasjoner, ble det gjort forsøk på å gjøre metoden mer robust. For å frigjøre mer FSY fra plasmakomponenter, ble prøvene tilsatt acetonitril, metanol, urea og natrium dodecyl sulfat uten at problemet med store resultatvariasjoner ble løst. Plasmaprøvene ble varmet opp, pH ble endret og man behandlet med en proteasecocktail, men heller ikke det ga ønsket resultat. Pga usikkerheten i målemetodene kunne man ikke konkludere med at co-administrasjon med andre proteiner (kasein) påvirket opptak av FSY, eller bestemme minimum dose for at FSY skal kunne tas opp til blodplasma over tarmvegg.
Milepæl 3 ble ikke oppnådd pga. variasjonene i resultatene.
Selv om man i disse analysene har konstatert at peptidet FSY passerer tarmveggen og absorberes til blodplasma i dyremodell (rotte), pekes det på at det må utføres flere undersøkelser, antakelig med annen metodologi for å oppnå alle milepælene i prosjektet.
Milepæl 2 bestod i å fastslå om FSY passerer tarmveggen og absorberes til blod og resultatene viste at ved å administrere en høy konsentrasjon av FSY (100 mg/kg) kunne det detekteres i blodet etter 1 time. En fant derimot ikke FSY i aorta-prøver. Siden metodene ga resultater med til dels store variasjoner, ble det gjort forsøk på å gjøre metoden mer robust. For å frigjøre mer FSY fra plasmakomponenter, ble prøvene tilsatt acetonitril, metanol, urea og natrium dodecyl sulfat uten at problemet med store resultatvariasjoner ble løst. Plasmaprøvene ble varmet opp, pH ble endret og man behandlet med en proteasecocktail, men heller ikke det ga ønsket resultat. Pga usikkerheten i målemetodene kunne man ikke konkludere med at co-administrasjon med andre proteiner (kasein) påvirket opptak av FSY, eller bestemme minimum dose for at FSY skal kunne tas opp til blodplasma over tarmvegg.
Milepæl 3 ble ikke oppnådd pga. variasjonene i resultatene.
Selv om man i disse analysene har konstatert at peptidet FSY passerer tarmveggen og absorberes til blodplasma i dyremodell (rotte), pekes det på at det må utføres flere undersøkelser, antakelig med annen metodologi for å oppnå alle milepælene i prosjektet.
-
Sluttrapport: Biotilgjengelighet for bioaktive peptider
D'Liver og Norut. 13.3.2014. Av Kjetil H. Elvevold (D’Liver) (prosjektleder), Mari Nilsen (D’Liver), Britt Fuglesteg (D’Liver) (ansvarlig dyreforsøk), Terje Vasskog (Norut) (ansvarlig LC-MS analyse).
Marine proteiner og peptider er spådd å bli den neste store utviklingen innenfor marin ingrediensindustri. Ernæringsmessige og helsemessige effekter fra marine proteiner/peptider ønskes utnyttet industrielt. Mange utfordringer, ikke minst regulatoriske godkjenninger, må forseres for å lykkes med kommersialisering.
For produkter som skal selges med godkjent helsepåstand er Det europeiske mattilsynet (EFSA) spesielt krevende med hensyn til dokumentasjon av sammenheng mellom produkt og påstått virkning. Mange aktører får ikke EFSAs godkjennelse for å markedsføre og selge produktet med godkjent helsepåstand på grunn av manglende dokumentasjon av sammenhengen mellom årsak (produkt) og virkning (påstått helseeffekt).
Kliniske effektstudier er ofte ikke tilstrekkelig, og ytterligere dokumentasjon knyttet direkte til hvordan produktet virker (mekanisme) må fremskaffes for å underbygge målte kliniske effekter.
I dette prosjektet skal det dokumenteres i hvilken grad oralt administrerte bioaktive peptider passerer fra tarmen til blodsirkulasjonen. Selv om det legges opp til å se nærmere på et bestemt peptid som hemmer et blodtrykksregulerende enzym, vil de beskrevne analyser også kunne benyttes på peptider med andre biologiske aktiviteter.
En positiv effekt kan i mange tilfeller måles i kliniske studier, men den faktiske årsaken til at peptidene virker systemisk, og slik som antatt, mangler.
I prosjektet vil det benyttes et ACE-hemmende (blodtrykksdempende) peptid utviklet av selskapet Marealis AS. Peptidet ekstraheres fra rekeskall. Man har antakelsen om at den underliggende mekanismen hemmer et angiotensin konverterende enzym (ACE) som er en viktig fysiologisk regulator av blodtrykket, og representerer et nøkkelenzym i behandling av høyt blodtrykk.
Den faktiske mekanismen har man pr i dag ikke dokumentert, og det er lite dokumentasjon på at ACE-hemmende peptider passerer fra tarmen til blodsirkulasjonen. Kun et arbeid fra Japan (Kawaguchi K, Nakamura T, Kamiie J, Takahashi T og Yamamoto N.) rapporterer at oralt administrerte peptider er gjenfunnet i endotelceller i aortaveggen, og forfatterne spekulerer i at disse peptidene kan ha en ACE-hemmende effekt.
For alle in vitro-analyserte (dvs. analysert i prøveglass) og dokumenterte bioaktive peptider, med antatt effekt på blodtrykk, kolesterol, inflammasjon, blodsukkerregulering eller andre fysiologiske og patofysiologiske parametere er det mht. dokumentasjon og godkjennelse viktig å finne svar på følgende:
• Passerer et oralt administrert peptid fordøyelsen, og passerer det tarmvegg og lever til blodsirkulasjonen?
• Om det påvises i blod, hvor raskt skjer overføringen og hvor stor andel av peptidet overføres totalt fra tarm til blod?
Jo flere slike spørsmål man kan besvare, desto mer relevant kunnskap vil ligge til grunn for å dokumentere peptidets effekt i kroppen.
For produkter som skal selges med godkjent helsepåstand er Det europeiske mattilsynet (EFSA) spesielt krevende med hensyn til dokumentasjon av sammenheng mellom produkt og påstått virkning. Mange aktører får ikke EFSAs godkjennelse for å markedsføre og selge produktet med godkjent helsepåstand på grunn av manglende dokumentasjon av sammenhengen mellom årsak (produkt) og virkning (påstått helseeffekt).
Kliniske effektstudier er ofte ikke tilstrekkelig, og ytterligere dokumentasjon knyttet direkte til hvordan produktet virker (mekanisme) må fremskaffes for å underbygge målte kliniske effekter.
I dette prosjektet skal det dokumenteres i hvilken grad oralt administrerte bioaktive peptider passerer fra tarmen til blodsirkulasjonen. Selv om det legges opp til å se nærmere på et bestemt peptid som hemmer et blodtrykksregulerende enzym, vil de beskrevne analyser også kunne benyttes på peptider med andre biologiske aktiviteter.
En positiv effekt kan i mange tilfeller måles i kliniske studier, men den faktiske årsaken til at peptidene virker systemisk, og slik som antatt, mangler.
I prosjektet vil det benyttes et ACE-hemmende (blodtrykksdempende) peptid utviklet av selskapet Marealis AS. Peptidet ekstraheres fra rekeskall. Man har antakelsen om at den underliggende mekanismen hemmer et angiotensin konverterende enzym (ACE) som er en viktig fysiologisk regulator av blodtrykket, og representerer et nøkkelenzym i behandling av høyt blodtrykk.
Den faktiske mekanismen har man pr i dag ikke dokumentert, og det er lite dokumentasjon på at ACE-hemmende peptider passerer fra tarmen til blodsirkulasjonen. Kun et arbeid fra Japan (Kawaguchi K, Nakamura T, Kamiie J, Takahashi T og Yamamoto N.) rapporterer at oralt administrerte peptider er gjenfunnet i endotelceller i aortaveggen, og forfatterne spekulerer i at disse peptidene kan ha en ACE-hemmende effekt.
For alle in vitro-analyserte (dvs. analysert i prøveglass) og dokumenterte bioaktive peptider, med antatt effekt på blodtrykk, kolesterol, inflammasjon, blodsukkerregulering eller andre fysiologiske og patofysiologiske parametere er det mht. dokumentasjon og godkjennelse viktig å finne svar på følgende:
• Passerer et oralt administrert peptid fordøyelsen, og passerer det tarmvegg og lever til blodsirkulasjonen?
• Om det påvises i blod, hvor raskt skjer overføringen og hvor stor andel av peptidet overføres totalt fra tarm til blod?
Jo flere slike spørsmål man kan besvare, desto mer relevant kunnskap vil ligge til grunn for å dokumentere peptidets effekt i kroppen.
Milepæl 1
Å fastslå om et peptid lar seg måle med tilstrekkelig høy sensitivitet og selektivitet i blodplasma ved hjelp av liquid chromatography–mass spectrometry (LC-MS).
Milepæl 2
• Å fastslå om peptid passerer tarmveggen og absorberes til blodplasma.
• Å bestemme om peptid bør administreres alene eller sammen med andre peptider.
• Å bestemme den orale konsentrasjon av peptid som er nødvendig for deteksjon i blod.
Milepæl 3
• Å oppnå statistisk signifikante resultater som indikerer at oralt administrerte bioaktive peptider kan passere fra tarm til blod.
• Å bestemme biotilgjengeligheten.
Å fastslå om et peptid lar seg måle med tilstrekkelig høy sensitivitet og selektivitet i blodplasma ved hjelp av liquid chromatography–mass spectrometry (LC-MS).
Milepæl 2
• Å fastslå om peptid passerer tarmveggen og absorberes til blodplasma.
• Å bestemme om peptid bør administreres alene eller sammen med andre peptider.
• Å bestemme den orale konsentrasjon av peptid som er nødvendig for deteksjon i blod.
Milepæl 3
• Å oppnå statistisk signifikante resultater som indikerer at oralt administrerte bioaktive peptider kan passere fra tarm til blod.
• Å bestemme biotilgjengeligheten.
Prosjektet skal gi grunnlag for forståelse om og dokumentasjon av biotilgjengeligheten til marine peptider med bioaktive egenskaper for human (og/eller animalsk) helse, ekstrahert fra marine restråstoffer. Dette skal være viktig bidrag til videre utvikling i norsk marin ingrediensindustri for posisjonering i markeder gjennom understøttende kunnskap og dokumentasjon.
Trinn 1: Utvikling og validering av metode for analyse av peptid i blodplasma
Som et viktig innledende trinn er det nødvendig å avklare hvorvidt peptid i plasma lar seg måle med tilstrekkelig høy sensitivitet og selektivitet ved hjelp av liquid chromatography–mass spectrometry (LC-MS).
Som et viktig innledende trinn er det nødvendig å avklare hvorvidt peptid i plasma lar seg måle med tilstrekkelig høy sensitivitet og selektivitet ved hjelp av liquid chromatography–mass spectrometry (LC-MS).
Trinn 2: Pilotstudie – Studie i forsøksdyr
Dette trinnet iverksettes etter at milepæl 1 er oppnådd.
Pilotstudien gjennomføres for å finne optimal konsentrasjon for deteksjon av oralt tilført peptid. Blodprøver av hvert forsøksdyr blir tatt med gitte tidsintervaller over en periode på opp til 24 timer. Prøvene analyseres på LC-MS.
Dette trinnet iverksettes etter at milepæl 1 er oppnådd.
Pilotstudien gjennomføres for å finne optimal konsentrasjon for deteksjon av oralt tilført peptid. Blodprøver av hvert forsøksdyr blir tatt med gitte tidsintervaller over en periode på opp til 24 timer. Prøvene analyseres på LC-MS.
Trinn 3: Hovedstudie – Studie i forsøksdyr
Iverksettes etter at milepæl 2 er oppnådd.
Basert på resultater fra pilotstudien administreres peptid til forsøksdyr for å oppnå statistisk signifikante resultater. Blodprøver av hvert forsøksdyr blir tatt med gitte tidsintervaller. Prøvene analyseres på LC-MS.
Iverksettes etter at milepæl 2 er oppnådd.
Basert på resultater fra pilotstudien administreres peptid til forsøksdyr for å oppnå statistisk signifikante resultater. Blodprøver av hvert forsøksdyr blir tatt med gitte tidsintervaller. Prøvene analyseres på LC-MS.
Det skal utarbeides en detaljert sluttrapport fra prosjektet. Resultater fra arbeidet skal presenteres i åpent møte for næringen og relevante FoU-miljø.
D’Liver vil utarbeide og få publisert vitenskapelig artikkel i etterkant av prosjektet, forutsatt at resultatene tilsier publiserbarhet.
D’Liver vil utarbeide og få publisert vitenskapelig artikkel i etterkant av prosjektet, forutsatt at resultatene tilsier publiserbarhet.
-
Sluttrapport: Biotilgjengelighet for bioaktive peptider
D'Liver og Norut. 13.3.2014. Av Kjetil H. Elvevold (D’Liver) (prosjektleder), Mari Nilsen (D’Liver), Britt Fuglesteg (D’Liver) (ansvarlig dyreforsøk), Terje Vasskog (Norut) (ansvarlig LC-MS analyse).