Prosjektnummer
901910
Utvikling av et diagnoseverktøy for gjelleskader fra nesledyr/ Development of a gill health diagnostic tool for cnidarian injuries (HydroDetect)
Gjellehelse forblir en av de viktigste årsakene til redusert vekst og
forhøyet dødelighet for oppdrettslaks. Forekomsten øker og tiår med
forskning kan ikke forklare en betydelig andel av gjellesykdomsrelatert
dødelighet som påvirkes blant annet av tilstedeværelse av marine arter
som maneter og hydroider, og driftsstrategier på oppdrettsanleggene.
Maneter kan påføre oppdrettslaks skade indirekte ved at manetsvermer tetter oppdrettsnøter og dermed hindrer tilstrekkelig vanngjennomstrømming i merdene. Dette fører i sin tur til dårlige oksygenforhold, apetittsvikt, sløvhet og endring i hoppeadferd.
Videre kan nesleceller fra både maneter og hydroider frigjøres i vannet som følge av driftsoperasjoner som notvask. Slike nesleceller har blitt vist å medføre nedsatt gjellefunksjon og utløse sekundær sykdom gjennom skader på gjellevev og hud. Det er per i dag få skadebegrensende strategier til bruk i slike tilfeller, og ingen lett tilgjengelige teknologier som kan identifisere opphavet til gjelleskade som kan framstå som patologisk like i histologiske undersøkelser. Det er derfor behov for å utvide forståelsen for hvordan gjellesykdommer kan detekteres og gjellehelse opprettholdes gjennom utvikling av praktiske og kostnadseffektive diagnoseverktøy som gjør det mulig å iverksette målrettede, skadebegrensende tiltak og endringer i oppdrettspraksis som begrenser omfang og konsekvenser. En mulig tilnærming er bruk av svabprøver kombinert med genetisk analyse (PCR) som allerede anvendes til diagnostisering av f.eks. amøbegjellesykdom.
Gjelle-svabring er ikke-destruktiv og har derfor en fordel fremfor dødelige prøvetakingsteknikker til histologiske analyser. Det hersker imidlertid tvil om hvorvidt prøvetaking med svab kan skade de følsomme gjellefilamentene. Prøvetaking fra innsiden av gjellelokk kan være et godt alternativ.
Prosjektet skal utføre en smittestudie for å utvikle en ikke-dødelig metode for genetisk analyse til identifikasjon av nesleceller i vann- og svabprøver fra gjeller som kan støtte og forbedre informasjonen som oppnås ved histologisk analyse. Fordi hydroider oppstår naturlig på oppdrettsnot kan prøvematerialet fra disse enkelt oppdrives og skal derfor benyttes som modellart for utvikling av en PCR-basert analysemetode for å detektere og kvantifisere hydroidematerialet i gjellemucus og i vannprøver. Prøvene skal tas fra fisk under kontrollerte smitteforsøk i tank.
Maneter kan påføre oppdrettslaks skade indirekte ved at manetsvermer tetter oppdrettsnøter og dermed hindrer tilstrekkelig vanngjennomstrømming i merdene. Dette fører i sin tur til dårlige oksygenforhold, apetittsvikt, sløvhet og endring i hoppeadferd.
Videre kan nesleceller fra både maneter og hydroider frigjøres i vannet som følge av driftsoperasjoner som notvask. Slike nesleceller har blitt vist å medføre nedsatt gjellefunksjon og utløse sekundær sykdom gjennom skader på gjellevev og hud. Det er per i dag få skadebegrensende strategier til bruk i slike tilfeller, og ingen lett tilgjengelige teknologier som kan identifisere opphavet til gjelleskade som kan framstå som patologisk like i histologiske undersøkelser. Det er derfor behov for å utvide forståelsen for hvordan gjellesykdommer kan detekteres og gjellehelse opprettholdes gjennom utvikling av praktiske og kostnadseffektive diagnoseverktøy som gjør det mulig å iverksette målrettede, skadebegrensende tiltak og endringer i oppdrettspraksis som begrenser omfang og konsekvenser. En mulig tilnærming er bruk av svabprøver kombinert med genetisk analyse (PCR) som allerede anvendes til diagnostisering av f.eks. amøbegjellesykdom.
Gjelle-svabring er ikke-destruktiv og har derfor en fordel fremfor dødelige prøvetakingsteknikker til histologiske analyser. Det hersker imidlertid tvil om hvorvidt prøvetaking med svab kan skade de følsomme gjellefilamentene. Prøvetaking fra innsiden av gjellelokk kan være et godt alternativ.
Prosjektet skal utføre en smittestudie for å utvikle en ikke-dødelig metode for genetisk analyse til identifikasjon av nesleceller i vann- og svabprøver fra gjeller som kan støtte og forbedre informasjonen som oppnås ved histologisk analyse. Fordi hydroider oppstår naturlig på oppdrettsnot kan prøvematerialet fra disse enkelt oppdrives og skal derfor benyttes som modellart for utvikling av en PCR-basert analysemetode for å detektere og kvantifisere hydroidematerialet i gjellemucus og i vannprøver. Prøvene skal tas fra fisk under kontrollerte smitteforsøk i tank.
Hovedmål
Å utvikle et PCR-basert assay som kan detektere og kvantifisere genetisk materiale av hydroiden Ectopeura larynx i svabprøver av gjellemucus og i vannprøver.
Delmål
1. Å utvikle et kvantitativt PCR (qPCR)-assay basert på genetisk materiale fra norsk E. larynx.
2. Å verifisere utviklet qPCR-assay gjennom et eksponeringsforsøk med atlantisk laks.
Å utvikle et PCR-basert assay som kan detektere og kvantifisere genetisk materiale av hydroiden Ectopeura larynx i svabprøver av gjellemucus og i vannprøver.
Delmål
1. Å utvikle et kvantitativt PCR (qPCR)-assay basert på genetisk materiale fra norsk E. larynx.
2. Å verifisere utviklet qPCR-assay gjennom et eksponeringsforsøk med atlantisk laks.
På kort sikt vil analysemetoden kunne utvikles til et verktøy for tidlig
varsling og diagnostisering til kvantifisering av risiko for gjellehelse
relatert til notvask, en av de vanligste operasjonene ved oppdrettsanlegg.
Metoden vil også kunne anvendes til vurdering av hvorvidt nye metoder
til begroingskontroll reduserer risiko for gjellehelseproblemer
sammenliknet med etablert praksis.
Skulle prosjektet lykkes i å etablere prøvetaking fra innsiden av gjellelokk med svab kan dette redusere unødvendig gjelleskade under rutineprøvetaking til sykdomsovervåking til fordel for fiskevelferden. På lang sikt vil prosjektet utgjøre en basis for liknende analyser for andre arter av nesleceller fra nesledyr (f.eks. maneter) med potensielt enda høyere skadepotensial.
Skulle prosjektet lykkes i å etablere prøvetaking fra innsiden av gjellelokk med svab kan dette redusere unødvendig gjelleskade under rutineprøvetaking til sykdomsovervåking til fordel for fiskevelferden. På lang sikt vil prosjektet utgjøre en basis for liknende analyser for andre arter av nesleceller fra nesledyr (f.eks. maneter) med potensielt enda høyere skadepotensial.
Prosjektet er delt inn i tre arbeidspakker (AP-er):
AP1: Formidling og administrasjon
Ansvarlig: Nina Bloecher (SINTEF)
Mål: Resultatformidling og prosjektkoordinering.
Aktivitet 1: Formidling
AP1: Formidling og administrasjon
Ansvarlig: Nina Bloecher (SINTEF)
Mål: Resultatformidling og prosjektkoordinering.
Aktivitet 1: Formidling
Aktivitet 2: Administrasjon
AP2: Utvikling av genetisk analysemetode til deteksjon av hydroidematerialet
Ansvarlig: Roman Netzer (SINTEF)
Mål: Utvikle en qPCR-analyse basert på genetisk informasjon fra E. larynx i Norge.
Forskningsspørsmål
1. Kan genetisk sekvensering benyttes til å identifisere genetiske biomarkører egnet til kvantitativ PCR-analyse?
2. Kan qPCR-teknologi benyttes til pålitelig kvantifisering av E. larynx-celler i prøver fra fisk og vann?
Aktivitet 1: Beskrivelse av transkriptom
Et eksisterende transkriptom fra E. larynx skal benyttes til å identifisere målgener som kan benyttes til utvikling av qPCR-testen.
Aktivitet 2: Design og validering av qPCR-analyse
Målgener fra aktivitet 1 skal benyttes til å utvikle en pålitelig og kostnadseffektiv, kvantitativ PCR-analysemetode basert på cDNA og DNA.
AP3: Smitteforsøk
Ansvarlig: Liv Østevik (NMBU)
Mål: Validere qPCR metoden gjennom et smitteforsøk.
Forskningsspørsmål
1. Kan qPCR-metoden benyttes til pålitelig deteksjon og kvantifisering av E. larynx-celler i mucus- og vannprøver?
2. Kan svabprøver fra gjellelokk gi samme informasjon som svabprøver tatt fra selve gjelleoverflaten som erstatning?
3. Hva er sammenhengen mellom qPCR og histologi?
4. Kan forskjeller i konsentrasjon av E. larynx i prøvene identifiseres i qPCR og histologi?
5. Hvor lenge etter eksponering kan nesleceller spores i svabprøver fra gjellemucus?
Aktivitet 1: Smitteforsøk
Smitteforsøkene skal utføres som tankforsøk ved VESO Aqualab på et tidspunkt hvor hydroider enkelt kan kultiveres, f.eks. høsten 2024. Smitteforsøkene vil bestå av 3 grupper:
1. Kontrollgruppe (ingen eksponering)
2. Hydroideeksponering, konsentrasjon 1
3. Hydroideeksponering, konsentrasjon 2
Prøver vil tas på 5 ulike tidspunkt og inkludere:
• 2. gjellebue på venstre side til histologi
• svabprøve fra høyre gjelle
• svabprøve fra høyre gjellelokk
I tillegg til prøvene fra fisk vil det tas vann- og hydroidprøver til henholdsvis test og validering av qPCR-analysemetoden. Den totale varigheten til eksperimentet vil være 3 uker.
Aktivitet 2: Prøveanalyse
Histologi: Én gjellebue dissekert fra hver fisk farges med haematoxylin-eosin (HE) til patologisk undersøkelse i mikroskop.
qPCR-data: Total DNA og RNA fra svab- og vannprøver isoleres og benyttes til kvalitetskontroll og kvantifisering. RNA-prøver behandles med DNase og benyttes som maler for revers-transkriptase basert cDNA-syntese. Både total DNA og cDNA vil benyttes som maler til kvantifisering av antall målgener gjennom bruk av qPCR-analysen utviklet i arbeidspakke 2.
Syntese: Statistiske metoder skal benyttes til å vurdere: (1) korrelasjonen mellom histologi og qPCR (både rt-qPCR og digital PCR)-data, (2) sammenlikning av resultatene av begge tilnærmingene til eksponeringskonsentrasjonen (dose-respons) og (3) utviklingen av gjellepatologi og tilstedeværelse av genetisk materiale over tid. Basert på resultatene skal anbefalinger til næringen utarbeides.
AP2: Utvikling av genetisk analysemetode til deteksjon av hydroidematerialet
Ansvarlig: Roman Netzer (SINTEF)
Mål: Utvikle en qPCR-analyse basert på genetisk informasjon fra E. larynx i Norge.
Forskningsspørsmål
1. Kan genetisk sekvensering benyttes til å identifisere genetiske biomarkører egnet til kvantitativ PCR-analyse?
2. Kan qPCR-teknologi benyttes til pålitelig kvantifisering av E. larynx-celler i prøver fra fisk og vann?
Aktivitet 1: Beskrivelse av transkriptom
Et eksisterende transkriptom fra E. larynx skal benyttes til å identifisere målgener som kan benyttes til utvikling av qPCR-testen.
Aktivitet 2: Design og validering av qPCR-analyse
Målgener fra aktivitet 1 skal benyttes til å utvikle en pålitelig og kostnadseffektiv, kvantitativ PCR-analysemetode basert på cDNA og DNA.
AP3: Smitteforsøk
Ansvarlig: Liv Østevik (NMBU)
Mål: Validere qPCR metoden gjennom et smitteforsøk.
Forskningsspørsmål
1. Kan qPCR-metoden benyttes til pålitelig deteksjon og kvantifisering av E. larynx-celler i mucus- og vannprøver?
2. Kan svabprøver fra gjellelokk gi samme informasjon som svabprøver tatt fra selve gjelleoverflaten som erstatning?
3. Hva er sammenhengen mellom qPCR og histologi?
4. Kan forskjeller i konsentrasjon av E. larynx i prøvene identifiseres i qPCR og histologi?
5. Hvor lenge etter eksponering kan nesleceller spores i svabprøver fra gjellemucus?
Aktivitet 1: Smitteforsøk
Smitteforsøkene skal utføres som tankforsøk ved VESO Aqualab på et tidspunkt hvor hydroider enkelt kan kultiveres, f.eks. høsten 2024. Smitteforsøkene vil bestå av 3 grupper:
1. Kontrollgruppe (ingen eksponering)
2. Hydroideeksponering, konsentrasjon 1
3. Hydroideeksponering, konsentrasjon 2
Prøver vil tas på 5 ulike tidspunkt og inkludere:
• 2. gjellebue på venstre side til histologi
• svabprøve fra høyre gjelle
• svabprøve fra høyre gjellelokk
I tillegg til prøvene fra fisk vil det tas vann- og hydroidprøver til henholdsvis test og validering av qPCR-analysemetoden. Den totale varigheten til eksperimentet vil være 3 uker.
Aktivitet 2: Prøveanalyse
Histologi: Én gjellebue dissekert fra hver fisk farges med haematoxylin-eosin (HE) til patologisk undersøkelse i mikroskop.
qPCR-data: Total DNA og RNA fra svab- og vannprøver isoleres og benyttes til kvalitetskontroll og kvantifisering. RNA-prøver behandles med DNase og benyttes som maler for revers-transkriptase basert cDNA-syntese. Både total DNA og cDNA vil benyttes som maler til kvantifisering av antall målgener gjennom bruk av qPCR-analysen utviklet i arbeidspakke 2.
Syntese: Statistiske metoder skal benyttes til å vurdere: (1) korrelasjonen mellom histologi og qPCR (både rt-qPCR og digital PCR)-data, (2) sammenlikning av resultatene av begge tilnærmingene til eksponeringskonsentrasjonen (dose-respons) og (3) utviklingen av gjellepatologi og tilstedeværelse av genetisk materiale over tid. Basert på resultatene skal anbefalinger til næringen utarbeides.
Prosjektresultater vil bli fortløpende formidlet på prosjektets nettsted. I
tillegg vil prosjektet bli formidlet på relevante møtesteder som
eksempelvis FHF-seminarer og Havbrukskonferansen.
Dersom en sammenheng mellom histologi og de genetiske analysene
avdekkes, skal det lages en brosjyre som forklarer sammenhengene og
som kan deles ut til personell i oppdrettsnæringen. Vitenskapelig
formidling skal skje i form av en fagfellevurdert artikkel, og en
prosjektrapport.